Roy D. Meléndez
Introducción
Las enfermedades de los animales domésticos en el neo trópico requieren de un diagnóstico acertado, confiable y oportuno a fin de tratar a un animal, prevenir la diseminación epidémica de esas dolencias, reducir o evitar la transmisión de una zoonosis a las personas y en general, contribuir a mantener los niveles de producción animal en las explotaciones del campo. Para lograr estos objetivos diagnósticos, el médico veterinario requiere del apoyo de los laboratorios de diagnóstico veterinario, privados u oficiales, donde enviar las diversas muestras de origen animal, así como también el estar actualizado en las técnicas de diagnóstico que se aplican a las mismas, a fin de seleccionar y solicitar las apropiadas e interpretar mejor los resultados que le emite el laboratorio. En el caso de las principales hemoparasitosis que se presentan en los animales domésticos del trópico, por ejemplo, anaplasmosis, babesiosis, tripanosomosis, ehrlichiosis, hepatozoonosis y dirofilariosis, a nivel mundial han ocurrido avances significativos o novedosos en las técnicas diagnósticas y de hecho la metodología empleada en las últimas tres décadas (desde 1980), ha evolucionado y cambiado constantemente. Así, de la técnica clásica y de uso diario en el diagnóstico de las hemoparasitosis como es la coloración con Giemsa aplicada a frotis sanguíneos delgados, se ha avanzado a las coloraciones realizadas en corto tiempo como el método del Diff-Quick o el Hemacolor. Estas coloraciones permiten, además del posible hallazgo de hemoparásitos intra o extracelulares, realizar hemogramas y conocer el estado de las células eritrocíticas o de la línea blanca. Sin embargo, estas técnicas parasitológicas con coloraciones, al ser comparadas con las técnicas inmunodiagnósticas, poseen limitaciones tales como a) baja sensibilidad, b) sólo dan resultados positivos si la parasitemia en sangre es alta o bien si el animal está en la fase“pico”o crítica de la enfermedad y c) hay aumento del número de animales “falso negativos” debido a su poca sensibilidad.
En el caso de la tripanosomosis la técnica parasitológica de rutina a nivel mundial es la técnica de Woo o del microhematocrito (Woo, 1969), la cual también posee baja sensibilidad; esta limitación se puede mejorar, en el diagnóstico de la ehrlichiosis, ya que luego de practicar la técnica de Woo se corta el microtúbulo para colectar la capa blanca, con la cual se hace un frotis fino y se colorea con Hemacolor o Giemsa. Esta concentración celular previa incrementa la sensibilidad del Woo y aumenta la posibilidad de diagnosticar los hemoparásitos. Actualmente, un laboratorio de diagnóstico veterinario para ser competitivo en el mercado de la prestación de servicios y reconocerlo como parcialmente actualizado, debe ofertar al gremio médico veterinario varias técnicas tales como test de inmunofluorescencia indirecta (IFI) o directa (IFD), el inmunoenzimático o test de ELISA, test de precipitación o aglutinación en placa o en tarjetas, entre otros. Es importante recordar que las técnicas inmunológicas (Tİs) para el diagnóstico de hemoparasitosis mediante la determinación de los niveles de anticuerpos generados por el hospedador contra el agente etiológico, tienen mayor valor en los estudios epidemiológicos de una enfermedad sobre un rebaño o región geográfica, no detectan al agente etiológico directamente, sino que fueron diseñadas para detectarlo indirectamente.
Los resultados emitidos usando estas Tİs nos dicen lo siguiente: 1) Si hay una infección activa según el título de anticuerpos detectados, 2) si los animales de un rebaño tuvieron, en el pasado, una infección con un microorganismo patógeno (monitoreo epidemiológico) y 3) si un animal es portador sano de un hemoparásito u otro microorganismo. Una técnica inmunodiagnóstica para un animal individual se solicitaría sólo en el caso de ser un animal muy valioso como un caballo pura sangre de carreras, un costoso semental bovino, nacional o importado, o bien un perro con destacado pedigrí, de lo contrario el uso rutinario de las Tİs en medicina veterinaria es con fines de realizar estudios epidemiológicos o monitoreo de una o varias enfermedades en rebaños animales de una zona geográfica dada, en un tiempo determinado. El resultado de las Tİs antes señaladas se expresa en “título de anticuerpos IgG o IgM”, y el título se define como la mayor dilución del suero sanguíneo de la muestra la cual aun da una reacción positiva con el antígeno en estudio, en este caso la Tİs es considerada como una técnica cuantitativa; ahora bien, si no se realiza dilución previa del suero con el buffer correspondiente, los resultados que emiten las Tİs serán cualitativos, es decir, sólo nos dicen si la muestra es positiva o negativa.
Las Tİs por lo general son laboriosas, consumen tiempo y se requiere que el laboratorio compre algunos equipos costosos y sofisticados; no obstante, en los últimos años las empresas internacionales que desarrollan comercialmente estas Tİs han logrado transformarlas en procedimientos rápidos, con diagnósticos emitidos en menos de 30 minutos, simplificar la metodología y casi hacerlas como técnicas de campo. El ejemplo que ilustra esta afirmación es la SNAP 4Dx ® (Lab. IDEXX), la cual se usa para el diagnóstico rápido de hasta cuatro (4) hemoparasitosis del perro, ehrlichiosis, dirofilariosis, anaplasmosis y enfermedad de Lyme. La SNAP 4Dx® usa la ELISA, pero muy simplificada, y de esta manera le da una sensibilidad confiable del 98% para el diagnóstico de las enfermedades arriba señaladas.
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Diagnóstico de las Hemoparasitosis con Técnicas Moleculares
Como es conocido desde 1980 ha ocurrido una revolución biotecnológica a nivel mundial, la cual ha llegado para quedarse y va a afectar a toda la humanidad. Los conocimientos que se han descubierto y acumulado en las últimas tres décadas sobre las funciones celulares del ácido desoxirribonucleico (ADN) en áreas como la herencia, la síntesis y expresión de proteínas, la genética, la producción de transgénicos, la clonación, estudios del genoma y otras áreas, han acelerado a su vez cambios en el diagnóstico de los agentes infecciosos. De hecho, el futuro del diagnóstico veterinario y médico de estos agentes u otros microorganismos está en el conocimiento, la actualización y el uso diario de Técnicas Moleculares (TEMOL) en los laboratorios diagnósticos.
A corto plazo es previsible que el diagnóstico a campo, incluso de especies de artrópodos transmisores de hemoparásitos patógenos, de bacterias o virus, se realice con TEMOL, así un investigador o veterinario podría llegar a una finca cargando una computadora portátil o una “tableta” (iPAD), un conjunto de “kits” que funcionarían con una microtécnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para detectar el ADN de insectos o microorganismos y un secuenciador portátil de ADN, capturar garrapatas o moscas hematófagas y analizarlas, tanto su contenido digestivo como el ADN propio del insecto y emitir a campo los diagnósticos siguientes: 1) decir con gran certeza que género y especie es el insecto capturado, 2) sobre que animal succionó sangre ese insecto, 3) que protozoos, bacterias o virus hay en su contenido digestivo y cuales de estos puede transmitir enfermedades a los otros animales o personas, 4) cual es el nivel de resistencia del insecto a insecticidas y 5) cual es su grado de especificidad con el hospedador donde fue capturado (Meléndez, 2000).
La técnica básica para estudiar el ADN es la PCR, descrita por vez primera por Kary Mullis (1983), premio Nóbel de Medicina 1993, la cual en 1996 fue transformada en una técnica cuantitativa denominada PCR en tiempo real o PCR cuantitativa y ésta ha demostrado ser una técnica altamente sensible y específica. En síntesis la PCR es una técnica que cumple dos objetivos: 1) un proceso inicial de aislamiento del ADN problema del microorganismo, artrópodo o muestra específica y 2) copiar múltiples veces las hebras del ADN aislado hasta tener una cantidad suficiente como para ser separada en un gel de electroforesis y fotografiar las bandas de ese ADN. La PCR se ha ido difundiendo e instalando en la mayoría de los laboratorios de diagnóstico del mundo y actualmente se puede obtener un resultado altamente confiable en menos de 12 horas, por ejemplo, cuando en mayo 2011 el ejército élite de USA dio de baja a Osama Bin Laden en Afganistán, en el portaviones Carl Vinson parece ser estaba instalado todo un laboratorio de diagnóstico molecular y en menos de 8 horas fueron capaces de identificar con altísima seguridad mediante la PCR y otras técnicas moleculares como la RFLP (Polimofismo Restringido en Frangmentos Largos) y la secuenciación del ADN extraído de las muestras de sangre, que el abatido era Bin Laden (El Universal, 04/05/2011).
Estas TEMOL y otras aun en desarrollo, van a cambiar la forma de diagnosticar agentes patógenos de los animales y el hombre, y modificar incluso conceptos de la biología de esos microorganismos, por ejemplo, no se sabía hasta el 2008 que la Babesia caballi y la Theileria equi podían infectar transplacentariamente a los fetos de potros, así en un estudio realizado en Brasil usando la técnica de PCR anidada se demostró que potros recién nacidos de yeguas portadoras de ambas Babesias nacieron positivos a estos hemoparásitos al ser detectadas en su sangre mediante la PCR (Santos y col., 2008). Otro ejemplo es que con las TEMOL se ha demostrado que la especie Babesia canis no es una especie única, sino que secuenciando su ADN se demostró que son tres especies diferentes: Babesia canis, Babesia vogeli y Babesia rossi las cuales a su vez son diferentes en su patogenicidad y en la garrapata vector que las transmite (Carret y col., 1999).
Por lo antes expuesto, es innegable que el futuro de la actualización de los laboratorios de diagnóstico veterinario o humano, está en el uso, oferta e implementación de TEMOL para facilitar, acelerar y garantizar la confiabilidad del diagnóstico de agentes patógenos, tanto parasitarios como de naturaleza viral o bacteriana.
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Bibliografía:
- Carret, C., Walas, F., Carcy, B., Grande, N., Précigout, E., Moubri, K., Schetters, T., y Gorenflot, A. (1999). Babesia canis canis, Babesia canis vogeli, Babesia canis rossi: Differentiation of the three Subspecies by a Restriction Fragment Length Polymorphism analysis on amplified small subunit ribosomal RNA genes. Journal of Eukaryotic Microbiology, Vol. 46: 298-303.Journal of Eukaryotic Microbiology. 46: 298-303.
- Meléndez, Roy D. (2000). Future perspectives on veterinary hemoparasite research in the tropics at the start of this century. En: Annals of the New York Academy of Sciences (NYAS). 916: 253-258.
- Santos Tiago, Santos, H. A., y Massard, C. L. (2008). Diagnstico molecular de babesiose congénita em potros neonatos no estado de Rio de Janeiro, Brasil. Rev. Bras. Parasitol. Vet. 17 (1): 348-350.
- Woo, P. (1969). The hematocrit centrifuge for the detection of trypanosomes in blood. Canadian Journal of Zoology. 47 (5): 921-923.
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